CRISPR-Cas基因編輯技術是本世紀頗具影響力的顛覆性創新技術，其發明者榮獲2020年諾貝爾化學獎。當前已開發CRISPR-Cas基因編輯工具多依賴于靶點DNA雙鏈切割，并需借助宿主自身的同源重組或者非同源末端連接DNA修復系統實現基因編輯，脫靶效應和編輯效率低是其瓶頸問題，阻礙了該技術在人類疾病治療等關鍵領域的應用。開發更高效精準的無需DNA雙鏈斷裂的基因編輯工具是該領域亟待解決的科學問題。
V-K型CRISPR相關轉座酶（CRISPR-associated transposases, CAST）系統可借助轉座機制而非DNA雙鏈斷裂實現基因的靶向整合插入，在精準、多重、無痕編輯及大片段刪除、插入等方向表現出巨大應用潛力，引起領域內多個頂尖團隊的重點關注，但研究方向尚局限于其基因編輯能力的應用探索和核心組分蛋白結構的解析，對其內源調控機理知之甚少。近日，中心與德國弗萊堡大學相關團隊合作，證實CAST系統在原生宿主藍細菌中受控于一類新型MerR-type轉錄調控因子CvkR (Cas V-K repressors)。該研究對CAST系統原型工作模式的認識和基因編輯工具的開發優化具有重要意義，相關成果發表于Nature Communications雜志。
CRISPR-Cas是原核生物中分布廣泛的一類免疫防御系統，可以攻擊入侵的病毒、質粒等外源遺傳元件，保護宿主細胞。轉座子則是可移動的遺傳因子，能夠在物種基因組上“跳躍”。因此，前者保持基因組的完整性，后者則破壞基因組的完整性，兩者是“天敵”。而CAST是上述防御和進攻元件的兼容系統，是生命進化史上“敵對勢力”之間攜手合作的典型案例，這一“化敵為友”的實現，即由轉錄調控因子CvkR來“協調”完成。
藍細菌是地球上最古老的生命形式之一，包含豐富多樣的CRISPR-Cas系統，本研究選擇了一類可以進行遺傳操作的絲狀藍細菌魚腥藻PCC 7120（
Anabaena
sp. PCC 7120）作為研究模式，該藻株基因組上至少包含11種CRISPR元件，其CAST系統（AnCAST）涵蓋一個長約21 kb的基因簇，包含CRISPR模塊（
cas12k
、CRISPR array、tracrRNA、crRNA）、Tn7轉座模塊（
tnsB
、
tnsC
、
tniQ
）和運載基因模塊三大組分（圖1）。
C
AST
系統的工作原理是由Cas
12
k效應蛋白和轉座酶協同作用
來催化RNA指導的DNA轉座
，可實現
在
pro
tospacer下游單向插入DNA
。
圖1 魚腥藻PCC 7120 CAST（AnCAST）系統
本研究立足AnCAST，基于全局性生物信息學分析，證實cvkR基因廣泛存在于藍細菌CAST系統，與cas12k鄰近且反向排布。通過遺傳學分析發現該系統的基因表達具備一個鮮明特征，即cas12k和cvkR均轉錄形成無5’-非翻譯區（5’-UTR）的leaderless mRNA，并證實CvkR在原生宿主中抑制CAST核心組分cas12k、tnsB和tracrRNA-crRNA的表達，是AnCAST的轉錄抑制因子。本研究還借助生化實驗，鑒定了CvkR轉錄因子特異性識別的核心motif（5’-AnnACATnATGTnnT-3’），深度解析了CvkR靶標啟動子的序列特征（圖2）。
圖2 AnCAST系統轉錄抑制因子CvkR識別motif的鑒定
為了進一步探究CvkR轉錄調控因子的作用機制，該工作還獲得了1.6 ?分辨率的CvkR晶體結構。證實該因子在溶液中以二聚體形式存在，具備典型MerR家族轉錄因子的基本特征（DNA結合結構域、二聚化結構域和效應物結合結構域），但其二聚化和效應物結合結構域的結構折疊模式均與結構已知MerR家族成員差別顯著，是一類非常新穎的MerR-type轉錄調控因子。作者還基于定點突變和系列生化實驗，初步鑒定了CvkR蛋白參與結合DNA的關鍵氨基酸殘基(圖3）。
圖3 MerR-type轉錄因子CvkR蛋白結構解析
綜上所述，該工作系統解析了An
CAST
系統的內源轉錄調控機制，鑒定了一個新型Me
rR-
type轉錄調控因子CvkR，發現其對C
AST
系統關鍵組分的表達起核心調控作用。本研究為未來新型位點特異性轉座型基因編輯工具的開發
奠定了重要的理論基礎。
德國弗萊堡大學Wolfgang R. Hess教授、中心主任呂雪峰研究員和朱濤
副研究員
為該論文的共同通訊作者，德方Marcus Ziemann、Viktoria Reimann和中心
副研究員
梁雅靜為本文的并列第一作者
。
本研究獲得了國家重點研發計劃、中德國際(地區)合作與交流項目、國家自然科學基金、中科院青島能源所科研創新基金等項目的資助。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-36542-9
Marcus Ziemann#, Viktoria Reimann#, Yajing Liang#, Yue Shi, Honglei Ma, Yuman Xie, Hui Li, Tao Zhu*, Xuefeng Lu*, Wolfgang R. Hess*. CvkR is a MerR-type transcriptional repressor of class 2 type V-K CRISPR-associated transposase systems. Nature Communications 14, 924. (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36542-9
文/圖：朱濤 梁雅靜
編輯：中心辦公室
