棘白菌素類抗真菌藥物是治療深部真菌感染的一線臨床用藥，其中米卡芬凈因存在天然磺酰化修飾具有很好的水溶性優勢。棘腔孢霉發酵生產的環脂肽類天然產物FR901379是米卡芬凈工業生產的前體化合物，其發酵效率低使得米卡芬凈生產成本居高不下，限制了米卡芬凈的市場應用。解析FR901379生物合成機制，開展工業菌株理性改造是提高生產效率的重要研究方向。近日，青島能源所微生物制造工程中心呂雪峰團隊解析了FR901379的完整生物合成途徑和調控機制，尤其是詳細闡明了磺酰化形成機制，在此基礎上通過代謝工程改造顯著提高了工業菌株的發酵性能，并基于磺酰化模塊創制了水溶性提高數千倍的新型磺酰化棘白菌素類化合物。相關成果發表于《代謝工程》（Metabolic Engineering, 2022）和《微生物細胞工廠》（Microbial Cell Factories, 2023）。
圖1 FR901379合成調控機制解析及其應用
研究團隊首先對FR901379合成基因簇進行了生物信息學預測，通過基因敲除進行了系統驗證并提出FR901379環脂肽骨架的生物合成途徑，包括非天然氨基酸底物合成模塊、環脂肽骨架組裝模塊和后修飾模塊（圖2）。但是，在核心基因簇mcf中始終未發現氧磺酰基模塊合成基因。研究團隊利用HMMER構建隱馬爾可夫模型，并結合差異轉錄組數據預測了可能負責氧磺酰基基團合成的候選基因。體內敲除和體外酶活結果表明氧磺酰化修飾由細胞色素P450酶McfP和磺酰基轉移酶McfS在環脂肽后修飾階段完成的（圖2），有意思的是這兩個修飾基因獨立于環脂肽母核核心基因簇，形成了一個獨立的磺酰化基因簇。更重要的，這兩個獨立基因簇通過簇內轉錄調控因子McfJ實現了合成過程的跨基因簇協同作用。研究團隊前期在土曲霉中也發現了這種跨基因簇協同調控現象，這可能是進化過程中絲狀真菌獲得復雜化合物合成能力的一種有效方式（Angew Chem Int Ed Engl, 2020, 132:4379-4383）。
圖2 FR901379生物合成途徑
闡明FR901379生物合成機制后，研究團隊針對棘腔孢霉發酵過程中存在產量低、副產物難分離等問題，開展了系統的工業菌株理性改造研究。首先，用強組成型啟動子對轉錄調控因子McfJ進行了過表達，使FR901379合成途徑全面上調，搖瓶產量也提高了3倍，達到1.32 g/L（圖3A）。為了減少因氧化不充分導致的中間產物積累，對關鍵的后修飾限速酶McfF和McfH進行過表達，合成途徑優化后副產物含量減少80%以上，產量也進一步顯著提高，最終在5 L發酵罐中產量達到4.0 g/L，高于現有工業水平（圖3B）。
圖3 棘腔孢霉代謝工程改造突變菌株發酵分析
磺酰基基團能夠增加化合物的水溶性，進而增加藥物的生物利用度，為了創制更多的磺酰化棘白菌素類化合物，研究團隊將磺酰化模塊在抗真菌藥物卡泊芬凈前體（紐莫康定B0）生產菌株中進行了異源重構，成功獲得了氧磺酰化紐莫康定B0，其水溶性提高了4000多倍，該研究為創制更多磺酰化棘白菌素類化合物提供了酶學元件和可行性驗證（圖4）。
圖4 異源重構磺酰化紐莫康定B0
該研究完整解析了FR901379的生物合成機制，在此基礎上對FR901379合成途徑的適配性進行了優化并創制了水溶性的新型磺酰化棘白菌素類化合物，為米卡芬凈生產工藝提質增效奠定了基礎，同時也為藥物水溶性提高提供了新思路。
微生物制造工程中心呂雪峰研究員和黃雪年研究員為上述兩篇論文的共同通訊作者，博士后門萍為論文的第一作者。該研究得到國家重點研發計劃青年科學家項目、國家自然科學基金、山東省人才計劃等基金的資助。
原文鏈接1：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.10.006
Men, P., Geng, C., Zhang, X., Zhang, W., Xie, L., Feng, D., Du, S., Wang, M., Huang, X*., Lu, X.*, Biosynthesis mechanism, genome mining and artificial construction of echinocandin O-sulfonation. Metab Eng, 2022, 74: 160-167.
原文鏈接2：https://doi.org/10.1186/s12934-023-02050-0
Men, P., Zhou,Y., Xie, L., Zhang, X., Zhang, W., Huang, X*., Lu, X.*, Improving the production of the micafungin precursor FR901379 in an industrial production strain. Microb Cell Fact, 2023, 22: 44.
已申請專利：
呂雪峰，門萍，黃雪年，耿策，謝麗，張璇；對棘白菌素類化合物氧磺酰化的酶及其應用，CN202210570357.8
呂雪峰，門萍，黃雪年，謝麗，杜思雨，張璇；氧磺酰化紐莫康定B0及其制備方法和應用，CN202210568966.X
呂雪峰，門萍，黃雪年，周宇，謝麗，王敏；一株高產FR901379的菌株及其構建方法與應用，CN202210570355.9
呂雪峰，門萍，黃雪年，謝麗，周宇，王敏；高產FR901379的菌株及其構建方法與應用，CN202210570328.1
